Síndrome de Li Fraumeni

Autoria: Juliana Klart

SÍNDROME DE LI FRAUMENI

PALMEIRA DOS ÍNDIOS/AL

2006/02

1. INTRODUÇÃO

A síndrome de Li-Fraumeni (LFS) caracteriza-se por mutações na linhagem germinativa, principalmente no gene TP53. Lee e Berstein sugerem que esse gene funcione como um guardião do genoma, evitando a proliferação de uma célula que tenha um dano genético. Essas alterações gênicas proporcionam uma alta taxa de tumores malignos na infância e em adultos jovens. Embora a mutação hereditária no TP53 seja muito rara nos diferentes cânceres humanos, ela tem sido freqüentemente detectada na LFS. As mutações do gene supressor de tumor TP53 em células germinativas tem sido demonstradas em 70% das famílias com diagnóstico clínico de LFS.

A mutação do TP53, que é a mais freqüente alteração genética detectada nos cânceres humanos, inativa as funções regulatórias de crescimento celular, causa a perda da atividade supressora de tumor e, em alguns casos, confere uma função promotora do tumor, com a ativação de genes envolvidos na proliferação celular, no aumento da sobrevida da célula e na angiogênese. Clinicamente essa síndrome afeta crianças e adultos jovens caracterizando-se por um grande espectro de tumores, incluindo tumores de partes moles, sarcomas ósseos, tumores de cérebro, da adrenal e de mama pré-menopausa. O diagnóstico clínico se faz através de critérios que relacionam o número de neoplasias, a idade em que surgem, os tipos e a distribuição dessas dentro da família.

A LFS é considerada uma desordem autossômica dominante negativa, padrão de herança característico de moléculas como a proteína p53. Esse padrão ilustra a complexidade genética que está por trás das mutações e justifica o crescimento das investigações no campo da patologia molecular.

Desde o advento de testes diagnósticos para detectar alterações em nível molecular, o número de casos diagnosticados tem aumentado drasticamente. Com o desenvolvimento do PCR e do Single-Strand Conformation Polymorfism (SSCP) pode se detectar a presença de alterações no DNA, que permite levantar expectativas sobre o surgimento de neoplasias na população.

A LFS está relacionada a uma alta taxa de morbimortalidade em conseqüência das diferentes localizações das neoplasias e das repercussões sistêmicas por elas provocada.

Não há um tratamento definitivo para familiares portadores dessa síndrome; entretanto, a detecção precoce da mutação poderá fornecer informações e orientar para futuras intervenções.

2. HISTÓRICO

Em 1968, Miller analisou 21.659 certificados de óbitos de crianças americanas que morreram de câncer e foi constatada uma alta taxa de mortalidade por sarcomas e também a presença de tumores cerebrais nos seus irmãos. Assim, Li e Fraumeni dedicaram-se a observar e a examinar crianças com rabdomiosarcoma. Em 1969, a LFS foi originalmente descrita a partir de uma evolução epidemiológica de mais de 600 revisões de histórias clínicas e familiares de pacientes com sarcoma na infância. A definição clínica da síndrome vem sendo refinada nas duas últimas décadas para o diagnóstico prospectivo de outras famílias.

Em 1975, Fraumeni et al. descreveram uma família com uma prole de nove adultos em que quatro morreram de leucemia linfocítica ou linfoma histiocítico e um morreu de macroglobulinemia de Waldenstrom complicada por adenocarcinoma de pulmão. Na geração subseqüente uma pessoa morreu de doença de Hodgkin. Quatro das nove pessoas saudáveis da família apresentam transformações linfocitárias com fitohemaglutinina e três desses tiveram elevação policlonal de IgM.

Embora muitos estudos fossem realizados com essas famílias, permaneceu-se indescritível por 20 anos o elemento causador da LFS. Então, estudos genéticos relacionaram o fato de famílias com a LFS apresentarem herança de alterações no gene supressor de tumor TP53. Em 1990, mutações em células germinativas no gene supressor de tumor TP53 foram identificadas em cinco famílias com o diagnóstico clínico de LFS. Estudos subseqüentes estabeleceram um padrão de recorrência autossômica dominante negativa de pelo menos seis tumores: câncer de mama prémenopausa, sarcomas de partes moles na infância, osteossarcoma, tumores de cérebro, carcinomas adrenocorticais e leucemia aguda.

Lynch et al. (2000) análisou um extenso segmento de uma família com excesso de tumores cerebrais e concluiu que se tratava de uma família com síndrome de Li-Fraumeni. Um paciente da linhagem genética direta apresentou rabdomiossarcoma com dois anos e cinco meses e aos quatorze anos, leucemia linfoblástica aguda e linfoma linfoblástico. O interessante é que nenhuma mutação no gene TP53 das células germinativas foi identificado em alguns membros da família, o que levou a pensar que outras mutações gênicas estão relacionadas a LFS. Atualmente se sabe que mutações em outros genes como o CHK2, por exemplo, também podem levar à síndrome.

3. EPIDEMIOLOGIA

O interessante da mutação do gene TP53 é que ela aumenta em 25 vezes a chance de uma pessoa de 50 anos desenvolver câncer se comparada com a população em geral. Em famílias portadores da LFS, a probabilidade de desenvolver qualquer câncer invasivo (excluindo carcinomas de pele) alcança em torno de 50% aos 30 anos,enquanto que na população em geral somente 1% desenvolve câncer. Mais de 90% dos portadores da mutação gênica desenvolverão câncer.

Segundo Stonea e colaboradores, a análise de famílias portadoras da síndrome identificou as diferentes prevalências entre o amplo espectro de neoplasias. Câncer de mama (39%), câncer cerebral (17%) e câncer de estômago (17%) foram os fenótipos mais freqüentemente encontrados. O câncer da adrenal, que é um achado típico da síndrome, não foi identificado neste estudo.

Hisada et al. (1998) quantificaram a incidência de segundo e terceiro câncer primário em indivíduos originários de 24 famílias com diagnóstico de LFS, entre 1968 e 1986. Das 200 pessoas com diagnóstico de câncer compatível com LFS, 30 (15%) desenvolveram um segundo tipo de câncer e 8 indivíduos (4%) desenvolveram um terceiro, enquanto 4 (2%) desenvolveram um quarto tipo. Além disso, o risco relativo de ocorrência de um segundo câncer foi de 5.3, com uma probabilidade acumulada de ocorrência de 57% de segundo câncer 30 anos depois de diagnosticado o primeiro. Os riscos relativos de um segundo câncer em famílias com essa síndrome foram de 83.0, 9.7 e 1.5 para indivíduos com um primeiro câncer antes dos 20 anos, dos 20 aos 44 anos e acima dos 45 anos, respectivamente.

4. ASPECTOS CLÍNICOS

Muitos estudos de acompanhamento de famílias portadoras da LFS foram realizados identificando os tipos de cânceres e a faixa etária das pessoas afetadas. O osteossarcoma está entre os tumores mais freqüentes quando associado a mutações do TP53. Os sarcomas de tecido mole e o câncer de mama são predominantes na LFS e aproximadamente 10% dos pacientes desenvolvem tumores cerebrais.

Portanto, a LFS foi inicialmente organizada através de observações clínicas seguidas de estudos epidemiológicos. A definição clínica desta síndrome tem sido ampliada para abranger tumores de células germinativas e tumor de Wilms. O espectro de cânceres, desta síndrome tem sido determinado incluindo carcinoma de mama, sarcomas de partes moles, tumores de cérebro, osteossarcomas, leucemias e carcinomas adrenais. Existem outros tumores freqüentemente observados nessa síndrome como melanoma, neoplasias gonadais, carcinomas de pulmão, pâncreas, próstata, entre outros.

Após inúmeras observações de famílias com um grande número de neoplasias e de acometimento de crianças e de adultos relativamente jovens, foram elaborados critérios para o diagnóstico da LFS.

1- Uma família incluindo dois parentes de primeiro grau com cânceres pertencentes ao espectro da LFS, sendo um dos parentes afetado antes dos quarenta e cinco anos.

2- Crianças ou adultos jovens com um raro tumor em relação a população em geral pertencente ao espectro da LFS, tal como o carcinoma da adrenocortical.

3- Criança ou adultos jovens com menos de quarenta e cinco anos com múltiplos tumores primários do espectro da LFS.

O diagnóstico clínico, portanto, se faz através de critérios que relacionam o número de neoplasias, a idade em que essas surgem, os tipos e a distribuição dessas dentro da família. Assim, a determinação da LFS é feita clinicamente, e posteriormente a análise molecular é realizada para identificar o gene mutado.

5. PATOLOGIA MOLECULAR

A proteína supressora de tumor p53, considerada a mais importante na prevenção do câncer tem sido estudada por mais de 20 anos. A primeira descrição da p53 foi como uma proteína celular que se liga ao antígeno SV40 T (Lane e Linzer).

Ironicamente, a p53 foi inicialmente classificada como uma proteína associada a transformação celular e como um proto-oncogêne, pois está freqüentemente super expressada em tumores e contribui para a imortalização e transformação de células primárias. No entanto, Levine et al. reconheceram que esses estudos detectaram p53 mutante, e num estudo publicado 10 anos depois da identificação da p53 mutante, eles demonstraram que a p53 selvagem, na verdade, inibe a transformação celular.

Subseqüentemente, a p53 foi mostrada como um elemento chave para a maquinaria de antiproliferação celular, capaz de induzir a apoptose ou a parada do ciclo celular em resposta a numerosos tipos de estresses. A perda dessa função é o principal contribuinte para a instabilidade genômica, transformação celular e tumorogênese.

O gene TP53 é altamente conservado em diversos organismos, sugerindo que a proteína codificada exerce um papel central e crítico na célula.

A mutação da p53 geralmente resulta em inativação da função supressora de tumor. No entanto, algumas formas mutantes também conferem um fenótipo com ganho de função, manifestado pelo aumento do crescimento celular e pelo potencial tumorogênico. Essa função promotora de tumor pode significativamente contribuir para a iniciação e/ou progressão de neoplasias.

A p53 mutada também é detectável em muitas células que se encontram em alta taxa de replicação, mesmo não-tumorais, mas é indetectável ou presente só em níveis pequenos nas células em repouso.

6. PADRÃO DE HERANÇA

A grande maioria das mutações implicadas na LFS são mutações do tipo “missence” e apresentam um padrão de herança do tipo dominante negativo. O que ocorre nessa situação é que a simples presença de um alelo mutante interfere completamente na ação do alelo normal. Esse fenômeno é próprio de proteínas de constituição multimérica (proteínas formadas por mais de uma cadeia polipeptídica, como é o caso da proteína p53). A sub-unidade mutante da proteína apresentará um domínio de ligação intacto e funcional, mas sua atividade catalítica estará alterada, afetando o papel de todo o multímero.

As conseqüências do alelo mutado, no surgimento de um fenótipo alterado, são devido à estequiometria da molécula p53, que é um tetrâmero. Na LFS, pode haver mutação “missence” em um dos alelos do gene TP53 que codifica as proteínas que formam o tetrâmero, assim alterando a molécula protéica.

Como é esperado 50% dos monômeros serão anormais e os outros 50% serão normais nos indivíduos heterozigotos. Em vista de que o tetrâmero da proteína p53 é formado pela disposição aleatória das diferentes cadeias polipeptídicas, a associação dessas cadeias (normais ou mutadas) pode produzir 5 moléculas diferentes e na mesma proporção: (I) normal sem cadeias mutadas, (II) alterada com apenas uma cadeia mutada, (III) alterada com duas cadeias mutadas, (IV) alterada com três cadeias mutadas e (V) alterada com todas as cadeias mutadas.

Como a presença de apenas uma cadeia mutada já é o suficiente para a perda de função da proteína p53 e para a formação de um fenótipo alterado, o indivíduo apresentará dentro de seu “pool” proteíco 80% de moléculas anormais e 20% de moléculas normais.

A LFS também pode ser originada em uma minoria dos casos por uma deleção do gene TP53 ou por uma mutação “nonsense”. Em ambos os casos, não há síntese do produto protéico pelo alelo mutado, conseqüentemente o indivíduo apresentará apenas 50% da quantidade de proteínas e essas serão normais. Depara-se, portanto, com um defeito quantitativo, ao contrário das mutações “missense” em que o defeito é qualitativo. Nessa situação o indivíduo ainda apresenta o fenótipo normal, uma vez que para desenvolver o câncer é necessário uma mutação somática no alelo remanescente, como é proposto por Knudson na hipótese “de dois eventos”.

Os distúrbios da LFS não vão se manifestar todos no início da vida. Na verdade, alguns se expressam em épocas variáveis, ou só na terceira idade. É fato que, por haver uma mutação da linhagem germinativa, os indivíduos já se apresentam com a mutação ao nascimento, apesar de não demonstrarem nenhum fenótipo neoplásico. Uma explicação para o posterior aparecimento dos cânceres é o efeito acumulativo de diferentes mutações somáticas que vão ocorrendo ao longo da vida até que se atinja um limiar de expressão. Dessa forma, portadores de mutações do gene TP53, mas sem malignidades, são considerados como grupo de risco para o desenvolvimento de neoplasias futuras.

7. DIAGNÓSTICO MOLECULAR

7.1 Polymerase Chain Reaction (PCR)

Trata-se de um método de rotina, fácil, rápido e que requer pouca quantidade de DNA do paciente, sendo capaz de detectar 90% das mutações de pares de base. Tal método exige apenas algumas células de qualquer fonte acessível e oferece o diagnóstico em poucas horas. Com o PCR, regiões específicas dos genes são amplificadas e isoladas do DNA de um paciente, e então a mutação pode vir a ser detectada. A análise do PCR usa a eletroforese de DNA desnaturado para se identificar “desigualdades” entre a amostra de um paciente e uma cópia normal da seqüência do gene ou seu RNAm. Essas desigualdades podem indicar um sítio em potencial de uma mutação responsável pelo espectro da LFS.

7.2 Single-Strand Conformation Polymorfism (SSCP)

Durante os últimos anos, o SSCP comprovou ser um método sensato e efetivo para se detectar mutações do DNA. A seqüência a ser analisada é amplificada pelo PCR e o produto dupla-fita é desnaturado pelo calor. Se o produto é rapidamente resfriado, as fitas simples dobram-se novamente sobre si mesmas numa conformação determinada pela seqüência primária da molécula de DNA. As diferentes conformações são estudadas sobre um gel de poliacrilamida. Em geral, as duas fitas de DNA têm um diferente padrão de migração e a mutação de ponto é mostrada prontamente. O SSCP parece detectar no mínimo 85% das mudanças de seqüência de curtos segmentos (200- 300 bp) de DNA. A sensibilidade poderá ser aumentada pela alteração do sistema de gel, através da adição de glicerol ou do resfriamento do gel durante a eletroforese.

7.3 Seqüenciamento

A técnica mais prática e eficiente para se detectar uma mutação é a que usa seqüenciadores automáticos. Uma das estratégias para o seqüenciamento fluorescente automático baseia-se na incorporação de produtos de extensão de DNA de marcadores fluorescentes, usando tanto primers marcados 5’ ou dideoxinucleotídeos marcados 3’. O método mais apropriado de marcação depende dos objetivos e das preferências pessoais.

Os seqüenciadores de DNA detectam a fluorescência dos quatros marcadores usados para identificar os nucleotídeos A, C, T e G. Cada marcador emite luz em um diferente comprimento de onda quando executados por um laser. As 4 cores e posteriormente as 4 bases podem ser detectadas e distinguidas por métodos de injeção capilar.

8. RASTREAMENTO E ACONSELHAMENTO GENÉTICO

Uma vez que a LFS é uma manifestação rara, que epidemiologicamente não atinge uma população bem definida (como é o caso dos judeus Askenasi, na Doença de Tay Sacks) e pelo fato de que essa síndrome não demonstra manifestações clínicas previsíveis, nem um tratamento específico, os métodos de rastreamento da síndrome ainda não são rotina dentro da genética humana.

A detecção precoce da mutação da linhagem germinativa do TP53, em pacientes com tumor pode ser oferecida tanto para crianças, quanto para adultos, num contexto de suporte psicossocial, para confirmar a LFS em bases moleculares. Isto permitirá, ao menos, oferecer ao paciente uma contínua revisão clínica e, por vezes, diagnosticar futuros cânceres em estágio inicial.

Entretanto, o aconselhamento genético é ainda uma das grandes dificuldades dentro da LFS. A diversidade fenotípica é muito intensa, variando de neoplasias de leves implicações clínicas até rabdomiossarcomas infantis e tumores cerebrais, dificultando em muito um planejamento para o futuro e impedindo que se faça suposições sobre o prognóstico. Além disso, herdar uma mutação do TP53 não é garantia de que o câncer se desenvolva, uma vez que este se originará pelo acúmulo de mutações somáticas durante a vida.

Assim, muito mais deve ser conhecido sobre a patogênese da doença para que se possa fazer um aconselhamento efetivo para as famílias com predisposição molecular ao câncer.

9. TRATAMENTO

9.1 Tratamento suporte e tratamento específico

Antes de se iniciar um tratamento específico, se possível todos os pacientes devem ter seu diagnóstico de câncer confirmado por histopatologia tecidual. Uma equipe de geneticistas, oncologistas, pediatras e cirurgiões deve estar envolvida, realizando uma série de cuidados que permitam situar o paciente em sua nova condição e adaptar-se física, psicológica e socialmente a ela.

Atualmente, dispõem-se das seguintes alternativas para o tratamento do câncer: cirurgia, radioterapia, quimioterapia, hormonioterapia, imunoterapia e bioterapia. A decisão da melhor conduta terapêutica dependerá do local, do tipo, da extensão, do número e principalmente da condição clínica do paciente. O principal objetivo da terapêutica ainda é oferecer alívio dos sintomas, com uma melhor qualidade de vida.

Entretanto, muitos desafios permanecem para ser resolvidos. Pesquisadores apresentaram dados ligando as mutações específicas do TP53 com um aumento da resistência do tumor à determinados quimioterápicos e também ao aumento das recidivas. Domínios entre os códons 163-195 e 236-256 contêm seqüências do tipo zinc-finger e parecem estar relacionadas a uma pior resposta dos pacientes aos diversos quimioterápicos e a um aumento da taxa de recidiva.

9.2 Expectativa para o futuro

Tratamentos efetivos e específicos para a LFS ainda não estão descritos, entretanto cientistas têm boas expectativas quanto ao desenvolvimento de novas terapias para o futuro.

Um dos mais freqüentes ativadores do TP53, usados em sistemas experimentais, é o anticorpo monoclonal Pab421. O anticorpo promove a ativação da seqüência ligadora de DNA da p53 desencadeando sua função. Determinados peptídeos de cadeias curtas também têm a propriedade de ativar a p53 em sistemas experimentais. O mecanismo de ativação desses peptídeos pode ser simplesmente por competir na interação do domínio central ao domínio C-terminal.

Ainda, a deleção de determinados aminoácidos do domínio C-terminal da p53 mutante pode abolir o ganho de função e também ativar a p53. Apesar da inibição da p53 mutante poder ser benéfica como terapia do câncer, o objetivo ideal seria não apenas abolir o ganho de função, mas também restaurar a função supressora de tumor.

Na verdade, esforços iniciais oferecem provas de que isso pode ser possível e o anticorpo monoclonal Pab421 tem algum potencial de restituir a função selvagem da p53 mutante.

Além disso, peptídeos sintéticos correspondendo ao domínio C-terminal da p53 restituem a atividade da seqüência específica de ligação ao DNA. Esses peptídeos sintéticos são suficientes para restaurar a transativação , supressão de crescimento e funções apoptóticas. Esse mecanismo ocorre porque resíduos no C-terminal da proteína p53 podem ser acetilados resultando em ativação da p53 selvagem. A determinação do mecanismo de ativação da p53 através da regulação do C-terminal é de grande importância pelo desenvolvimento de terapêuticas baseadas na p53, que objetivam restaurar a função da p53 selvagem e/ou inibir o ganho de função da p53 mutante.

9.3 Terapia gênica

Terapia gênica é a modificação das células dos pacientes afim de combater uma doença. Entre as diferentes estratégias de terapia gênica está a utilizada por Roth e colaboradores. Eles investigaram os efeitos da injeção em tumores (carcinoma de nãopequenas células) do gene TP53 usando para isso um agente retroviral. Após a injeção, a regressão tumoral ocorreu em 3 pacientes e o crescimento tumoral foi estabilizado em outros três. Chen e colaboradores estudaram o efeito de produzir cópias simples de p53 selvagem exógena e injetou em tumores, obtendo supressão do fenótipo neoplásico.

Entretanto, a terapia gênica da linhagem germinativa em humanos ainda não tem sido utilizada por conceitos éticos e pela limitação da tecnologia para manipulação das células de linhagem germinativa.

10. CONCLUSÃO

TP53 é o gene mais comumente mutado dentro dos cânceres humanos, sendo que as conseqüências de suas alterações são profundas. Evidências sugerem que a proteína p53 exerce uma regulação na progressão do ciclo celular, assim como no mecanismo de morte celular programada, em resposta à lesão do DNA.

A mutação germinativa do gene TP53 deve ser procurada em todos os tipos de cânceres que mostram alguma forma de apresentação familiar, em casos de tumores multifocais e em casos de neoplasias malignas secundárias. Este é o principal interesse da comunidade médica, tanto clínica quanto científica.

Pouco a pouco, vão se conhecendo os mecanismos do TP53 na gênese do câncer e com isto novas estratégias terapêuticas ganharão campo e poderão ser aplicadas no tratamento de muitas neoplasias malignas. Na verdade, o estudo de novas famílias ajudará a melhor entender os mecanismos moleculares envolvidos na LFS e permitirá identificação dos membros portadores de câncer e oferecer a eles medidas preventivas.

11. BIBLIOGRAFIA

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